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Revista Ingeniantes 2019 Año 6 No. 2 Vol. 2
y 2018 se adquirió aproximadamente 1 kg de carpófo-
ros de Laccaria laccata en el mercado de la Central de
Abastos de la ciudad de Oaxaca.
Los hongos frescos se almacenaron de acuerdo al si-
guiendo procedimiento: se lavaron con agua destilada,
se dejaron escurrir por 30 minutos, se colocaron en
bolsas de papel; posteriormente los hongos se conge-
laron a una temperatura de -20°C hasta su uso.
Inoculación en AEM (agar extracto de malta)
Se realizó el fraccionamiento del hongo L. laccata, ob-
teniendo tres secciones: lámina (lamela, himenio), píleo
(sombrero) y estipe o estípite (pie). De estas fraccio-
nes se utilizaron aproximadamente 0.5 cm2 de cada
uno para inocular en cajas Petri con AEM.
Identificación de lectinas por hemaglutinación en
AEM
Se depositaron muestras de 1cm2 de cada cultivo en tu-
bos Eppendorf en condiciones estériles y se diluyeron
en 200μl de Buffer Fosfato Salino (conocido también
por sus siglas en inglés, PBS, de phosphate buffered
saline), pH 7.2. Estas fracciones del hongo se centrifu-
garon a 3000 rpm por 5 minutos en una centrifuga mar-
ca SOL-BAT para utilizar la biomasa.
Para el ensayo de hemaglutinación se utilizó la técni-
ca de diluciones seriadas empleando una solución de
eritrocitos humanos tipo O, al 3 % [13]. Para identificar 8) Sesquiterpenlactonas, a la muestra se le agregó 2
la actividad hemaglutinante se emplearon placas de mi-
crotitulación de 96 pozos de fondo ”U” (lavadas con
agua destilada y desinfectadas previamente con cloro),
de acuerdo al siguiente protocolo: en la primera fila se
aplicó un control del ensayo colocando solamente 50
μl de PBS pH 7.2 y 25μl de eritrocitos en cada pozo, en
la segunda fila se colocaron (en ese orden) 50 μl de
PBS a partir del pozo 1 hasta el pozo 12, enseguida se
depositó 50 μl de muestra problema al primer pozo y
se fue diluyendo en toda la fila de pozos, y desechando
los últimos 50 μl del último pozo. Finalmente se coloca-
ron 25 μl de eritrocitos al 3 % en cada pozo. La placa
se agitó suavemente y se dejó reposar por 45 minutos
a temperatura ambiente para su posterior lectura.
Inoculación en CEM (caldo extracto de malta)
Se inoculó aproximadamente 1 cm2 de cada cultivo
(medio sólido) en cada matraz Erlenmeyer con 30 ml
de cultivo de CEM. Estos se incubaron a 25°C con una
velocidad de agitación de 60 rpm durante 17 días.
Identificación de lectinas por hemaglutinación en CEM
Se tomaron muestras de 200µl en tubos Eppendorf en
condiciones estériles, las cuales se sometieron al mis-
mo proceso de centrifugación para utilizar la biomasa y
el sobrenadante de los cultivos. Se colocaron 50µl de
muestra en cada pozo de la placa de microtitulación,
repitiendo el procedimiento anterior de evaluación de
actividad hemaglutinante.
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Identificación de familias de metabolitos secunda-
rios por métodos colorimétricos
Se seleccionó el cultivo con la fracción píleo de L. lac-
cata para la identificación de las familias de metaboli-
tos secundarios por pruebas fitoquímicas colorimétri-
cas [14, 15 y 16].
1) Para la identificación de alcaloides se empleó el en-
sayo Drangendorf y el ensayo Wagner;
2) Para la identificación de flavonoides se adicionaron
3 gotas de NaOH a una porción de muestra diluida en
etanol, la presencia del color amarillo después de la re-
acción indica que es positiva;
3) Para la identificación de saponinas se empleó la téc-
nica de la espuma, es positivo si la altura de la espuma
es >0.5cm por 30 minutos;
4) Para taninos se empleó el reactivo de gelatina, y el
reactivo de FeCl3;
5) Cumarinas, a una muestra con etanol se le añadieron
2 gotas de NH4OH, una coloración azul-violeta significa
positivo;
6) Quinonas, al residuo seco obtenido de 1ml de mues-
tra se le añadió etanol y NaOH, da positivo si hay una
coloración rojo-violeta;
7) Glucósidos cardiotónicos, se empleó la prueba de
Baljet;
gotas de clorhidratohidroxilamina 2N, 1 gota de KOH y
metanol, se calentó a ebullición durante 2 minutos, se
acidificó a pH 1 y finalmente se adicionó 1 gota de FeCl3
, es positivo si vira a rojo, violeta o rosa en fase acuosa.
RESULTADOS
Conservación de los hongos obtenidos
El hongo L. laccata (Figura 3) en estas condiciones a
-20°C en bolsas de papel, mantienen discretamente su
actividad bioactiva.
Figura 3. Laccaria laccata
Elaboración: Autora, 2019
Actividad de lectina en AEM
El cultivo de la fracción estipe de L. laccata presentó
13 pozos positivos (empezando en la fila 1 de izquierda